【关键词】 分离与提纯
摘要：
【目的】探讨化橘红中柚皮苷元含量的特点。
【方法】采用反相高效液相色谱法（HPLC）测定不同化橘红中的柚皮苷元含量，流动相A：甲醇，流动相BV水：V乙酸＝６１∶４，进行梯度洗脱，流速为10mL/min，检测波长283?nm。
【结果】在0088～0880μg范围内，柚皮苷元与色谱峰面积呈良好的线性关系，r＝0999?9，平均加样回收率为9549%，RSD＝200%（n＝５）；化橘红23个样品中柚皮苷元含量均在01～10?mg・g－１之间。
【结论】首次建立了测定化橘红中柚皮苷元含量的HPLC法，方法准确、重现性好；化橘红各品种中的柚皮苷元含量稳定，毛橘红和光橘红的差异无显著性。
关键词：化橘红／分离与提纯； 柚皮苷元／化学；色谱法，高压液相
化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’和柚Citrus grandis（L．）Osbeck．未成熟果实的干燥外层果皮［１］，前者称毛橘红，后者称光橘红。化橘红有散寒、燥湿、消痰、利气等功效，用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕恶痞闷等［１］。化橘红富含黄酮类等成分，主要为柚皮苷Naringin、野漆树苷Rhoifolin等［2］。已有人测定了化橘红中柚皮苷含量［2］，但尚未见测定化橘红中柚皮苷元含量的报道。本文以高效液相色谱法测定化橘红中柚皮苷元含量，并对毛橘红与光橘红中柚皮苷元的含量进行了比较分析。
1 仪器、试药与材料
1-1 仪器与材料 Summit 580型高效液相色谱仪系列（德国Dionex）；Sartorius BP211D电子分析天平（德国）；电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）。
1-2 试药 柚皮苷元对照品（为自己分离所得，经综合解析为柚皮苷元，纯度为9856%）；甲醇（色谱纯）；石油醚（60～90℃）、冰醋酸等均为分析纯。
1-3 材料
毛橘红1：2000年5月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为70cm；
毛橘红2：2000年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为45cm；
毛橘红3：2000年8月采于广东省化州市平定镇，药材直径不小于4cm；
毛橘红4：2000年8月采于广东省化州市平定镇，药材直径不小于6cm；
毛橘红5：2002年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径小于30cm；
毛橘红6：2002年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为16～26?cm；
毛橘红7：2002年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为25cm；
毛橘红8：2002年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为35cm；
毛橘红9：2002年4月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为28～44cm；
毛橘红10：2002年6月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为20～54cm；
毛橘红11：2002年6月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为54～68cm；
毛橘红12：2002年6月采于广东省化州市平定镇，药材直径约为55～65cm。
光橘红1：产自湖南省，药材直径约40?cm；
光橘红2：产自广西省，药材直径约70?cm；
光橘红3：购自海南省海南大学附属医院，市售药材直径约92?cm；
光橘红4：购自北京西单金象大药房，市售药材直径约113cm；
光橘红5：购自河南省郑州市医药总公司医药大厦，市售药材直径约105cm；
光橘红6：购自广东省揭阳市汇康医药有限公司，市售药材，切片；
光橘红7：购自湖南省常德市吉春堂药店，市售药材，切片；
光橘红8：购自云南省楚雄市延寿堂连锁店，市售药材，切片；
光橘红9：购自浙江省绍兴，市售药材，切片；
光橘红10：购自山西省太古山西中药厂药材经销部，市售药材，切片；
光橘红11：购自广西省，市售药材直径约30?cm。
2 测定方法
2-1 色谱条件 流动相A：甲醇，流动相B：Ｖ水∶Ｖ乙酸＝６１∶4，采用梯度洗脱；色谱柱：MACHEREYNAGEL（1005Ｃ１８，５μm，250?mm×４6mm）；流速：10mL/min；检测波长：283?nm；柱温：25℃。
2-2 供试品溶液的制备 精密称定已干燥恒重的样品1000?g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）100?mL，水浴回流提取25?h，弃去石油醚液；待样品中残存的石油醚全部挥去后，加甲醇100?mL，再置水浴中回流提取4?h以上，提取至无颜色；放冷，滤过，滤液浓缩并转移至10?mL量瓶中，以甲醇少量分数次洗涤容器及滤纸，洗涤液并入同一量瓶中，甲醇定容至刻度，即得。
2-3 柚皮苷元对照品溶液的制备 准确称取经干燥（105℃）至恒重的柚皮苷元对照品，加甲醇溶解，制成0088?mg/mL溶液，作为对照品。
3 结果和讨论
3-1 吸收波长的确定 进行光谱扫描，在283?nm处有一较强吸收峰，故确定283?nm为吸收波长。
3-2 标准曲线 用微量进样器分别准确吸取对照品溶液各2、4、6、8、10?μL，依次进样，并记录峰面积。以进样体积（μL）为横坐标、峰面积（mAU・min－１）为纵坐标绘制工作曲线，求得柚皮苷元的回归方程为Ｙ＝５１４１９Ｘ－０７５１０，r＝０９９９９。在0088～0880?μg范围内，柚皮苷元与色谱峰面积呈良好的线性关系。
3-3 方法学验证
3-3-1 稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别在0、15、35、55、25、27?h不同时间点进行测定，考察保留时间和峰面积的一致性，柚皮苷元的保留时间RSD和峰面积RSD分别为0279%和268%。
332 精密度试验
取同一份供试品溶液，连续进样5次，考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性，柚皮苷元的保留时间ＲＳＤ和峰面积的ＲＳＤ分别为0304%和204%。
3-3-3 重现性试验
取同一批供试品5份，同法检测，考察色谱峰保留时间的一致性，柚皮苷元色谱峰保留时间ＲＳＤ为286%。
3-3-4 回收率试验
以同一批样品1g（5份），精密称定，分别准确加入柚皮苷元对照品各0176?mg，按供试品溶液制备方法制成样品溶液，各取10μL进样，测定含量，结果柚皮苷元平均加样回收率为9549%，ＲＳＤ＝２00%，结果见表1。
3-4 供试品的测定 准确吸取供试品溶液各10?μL，注入高效液相色谱仪中，按高效液相色谱法进行试验，以柚皮苷元对照品为参照物，依法测定并记录色谱图。外标法计算含量，结果见表2，对照品及供试品色谱图见图1。
3-5 讨论
对样品提取方法中所用溶剂进行薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）考察表明，石油醚中检测不到柚皮苷元，甲醇中则存在柚皮苷元；而且，方法学考察也表明，先用石油醚去挥发油，然后用甲醇提取的方法具有可行性。
测定结果表明，化橘红中柚皮苷元含量基本均在01～10mg・g－１之间，毛橘红与光橘红中柚皮苷元含量无明显差异。
表1 柚皮苷元(Nar)加样回收率（略）
表2 柚皮苷元(Nar)含量测定结果（略）
图1 柚皮苷元HPLC图（略）
对柚皮苷元含量与药材直径进行比较的结果表明：柚皮苷元含量与药材直径成反比，直径越大，含量越低；而直径大小与果龄（即果实生长期）成正比，果龄越大，直径越大，即随着果龄的增长，柚皮苷元含量逐渐降低，这与化橘红中总黄酮含量的变化趋势一致［３］。但化橘红的指纹图谱研究显示柚皮苷元比其他黄酮类成分更稳定［４］。因此，柚皮苷元含量有可能作为衡量化橘红质量优劣及果龄长短的指标之一，为化橘红的质量控制及采收期的确定提供依据，其确切关系有待进一步深入研究。
本文首次建立了测定化橘红中柚皮苷元含量的HPLC法，方法简便准确，重现性好，空白无干扰，适用于化橘红中柚皮苷元含量测定。
参考文献：
［1］中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．广州：广东科技出版社，2000．56．
［2］黄美声，沈玉刚．反相高效液相色谱法测定化橘红中柚皮甙的含量［Ｊ］．中草药，1990，21（5）：15．
［3］袁旭江，林励，陈志霞．果龄对化橘红化学成分含量的影响［Ｊ］．中药新药与临床药理，2003，14（3）：188．
［4］袁旭江．化橘红药材指纹图谱及其质量研究［D］．广州中医药大学学位论文，2003．39．